تشخیص دقیق تر آلودگى هاى مایکوپلاسمایى در طیور

تشخیص دقیق تر آلودگى هاى مایکوپلاسمایى در طیور

مقدمه

براى اجراى برنامه هاى کنترل مایکوپلاسما به آزمایش هایى با ویژگى بالا به همراه حساسیت کافى و نمونه گیرى مکرر نیاز است واکنش هاى مثبت کاذب قادرند تا خسارات جدى به بار آورند به طورى که منجر به حذف یک گله غیر آلوده شو ند و درنتیجه از میزان مقبولیت برنامه ى پیشگیرى بکاهند . با اینحال آلودگى هاى تشخیص داده نشده ى اخیر خطر انتشار آلودگى را به سایر مزارع از طریق انتقال عمودى یا افقى افزایش مى دهند تعیین عفونتى که به تازگى رخ داده است بستگى زیادى به تکرار نمونه گیرى تعداد نمونه اخذ شده و حساسیت آزمایش انجام گرفته دارد . هیچ گونه آزمایش سرولوژیک با حساسیت و ویژگى صد در صد وجود ندارد در واقع حساسیت و ویژگى رقیبان یکدیگرند . افزایش حساسیت یک ازمون از ویژگى آن خواهد کاست بنابراین همیشه یک آزمایش به صورت توافقى انتخاب مى شود و مبناى کار قرار مى گیرد . پیش از آنکه بتوانیم نتایج آزمایش هاى سرولوژى را تفسیر کنیم باید مجموعه اى حاوى تعداد زیادى از داده ها در اختیار مان باشد بدون این داده ها تفسیر نتایج عملى حساس و خطرناک خواهد بود بخشى از داده هاى مورد نیاز از بیرون و قسمتى از داخل آزمایشگاه به دست مى آیند .

اطلاعات حاصله از بیرون آزمایشگاه

·        نمونه بردارى از کدام حیوانات (پرندگان ) یا موادى صورت گرفته است ؟

·        نمونه ها در کدام مرحله از بیمارى یا آلودگى اخذ شده اند ؟

·        تعداد نمونه ؟

·        میزان شیوع مورد انتظار عفونت ؟

·        آیا طیور واکسینه شده بودند ؟ بلى یا خیر؟ چه وقت ؟با کدام واکسن ؟ روش واکسیناسیون؟

·        سن پرندگان ؟ وضعیت آنتى بادى هاى مادرى آنها ؟

داده هاى آزمایشگاهى

·        آزمایش قرار است چه چیزى را تعیین کند (igm  ، igG ، پادتن هاى رسوب دهنده و غیره )؟

·        حساسیت آزمون ؟ زمان بین آلودگى و تغییرات سرمى مورد انتظار؟

·        ویژگى آزمون ؟

·        از این مقادیر پیش بینى نتایج آزمایش حساسیت و ویژگى گله قابل استنباط خواهد بود رابطه ى حساسیت ، ویژگى ، ارزش پیش بینى و میزان شیوع ( درصد پرندگان آلوده ) در تابلو یک شرح داده شده است :

حساسیت

حساسیت درصدى از پرندگان آلوده است که توسط آزمایش قابل تشخیص است و به صورت aa+c نمایش داده مى شود یک نتیجه ى منفى کاذب به دست امده از بررسى سرمى مایکوپلاسما ، جواب آزمایشگاهى منفى براى نمونه اى است که از یک پرنده آلوده تهیه شده است دلایل ممکنه براى بروز چنین حالتى عبارتند از :

·        خود آزمایش میزان حساسیت نیست .

·        زمان نمونه بردارى پس از آلودگى هنوز زود بوده است .

نتایج آزمایشگاهى

پرندگانى که به طور انفرادى با mg یا ms تلقیح شوند اغلب سطح قابل اندازه گیرى از آنتى بادى ها را بعد از یک هفته ( آزمایش RPA یا آگلوتیناسیون سریع روى پلیت تعدادى از کیت هاى ELISA ) تا 5/1 هفته (آزمایش HI ) نشان مى دهند . با وجود این در عمل و در شرایط گله آلودگى مایکوپلاسمایى در یک آشیانه قبل از آنکه تشخیص داده شود از اولین طیور آلوده به سایرین انتقال مى یابد و منتشر مى شود که این امر منجر به تاخیرى در تعیین آنتى بادى ها در سطح گله خواهد شد زمان بین آغاز آلودگى در بعضى پرندگان و تشخیص پادتن ها در سطح گله به راحتى مى تواند تا 3 هفته هم طول بکشد . هنگامى که طیور جدیداً آلوده شده با یک آنتى بیوتیک درمان مى شوند تا از انتشار سویه ى مایکوپلاسما در میان گله کاسته شود تعداد پرندگان آلوده مى تواند موقتاً پایین بماند که این شانس تشخیص را در آن برهه ى زمانى کاهش مى دهد .

·        هیچ گونه پاسخ ایمنى هر مورال قابل اندازه گیرى وجود ندارد .

- همه ى سویه هاى مایکوپلاسماها سطح یکسانى از پاسخ ایمنى هر مورال القا نمى کنند سویه اى تخفیف حدت یافته پاسخ ایمنى کمترى از سویه اى اصلى مزرعه ایجاد مى کنند در میان مقالات گزارش هایى از سویه هاى به اصطلاح غیر مشخص به چشم مى خورد حاکى از آن که سویه ها در آزمایش هاى RPA ، HI و ELISA ردى از خود به جا نمى گذارند : ولیکن با حساسیت پایین ترى مى توان آنها را با کشت و یا در آزمایش PCR یافت .

- آزمایش HI نسبت به سویه اختصاصى عمل مى کند.

- نمونه دیگرى از سطح بسیار پایین و غیر قابل تشخیص پاسخ هاى هر مورال مى تواند به همراه بعضى از واکسن هاى زنده تخفیف حدت یافته مشاهده شود.

قبل از انجام آزمایش پاسخ ایمنى کاهش پیداکرده است . استفاده از اغلب واکسن هاى کشته Mg منجر به ایجاد سطوح بالاى تیتر در ازمایشگاه هاى RPA و HI در نخستین ماه هاى بعد از واکسیناسیون مى وشد در طى دره تخمگذارى این تیترها به سطح پایینى تقلیل مى یابند بخشى از این گله ها حتى ممکن است دوباره از لحاظ سرمى منفى شوند.

با استفاده از این تجربیات گله هاى واکسینه اى که در انتهاى دوره ى تخمگذارى هنوز عیار آنتى بادى بالایى دارند مظنون به این هستند که آلودگى در آنها موجب یادآورى پاسخ ایمنى شده است .

·        اثر Prozone یا اثر Dose-Hookhigh :

این اثر توسط سطح بسیار بالاى پادتن هایى ایجاد مى شود که به سرولوژى مایکوپلاسما مربوط نیستند.

ویژگى

ویژگى درصد پرندگان غیر آلوده است که نتیجه ى آزمایش منفى دارند وبه صورت db+d نمایش داده مى شود یک نتیجه ى مثبت کاذب در بررسى سرمى مایکوپلاسماها یک پاسخ آزمایش مثبت از نمونه اى است که به یک پرنده ى غیر آلوده تعلق دارند دلایل احتمالى چنین وضعى شامل مواردزیر است :

·        خود آزمایش : به عنوان مثال کیفیت آنتى ژن کیفیت مجموعه ى مورد استفاده در آزمایش ثبات مواد مورد استفاده در آزمایش تا پایان مهلت انقضا .

نحوه ى انجام آزمایش زمانى استفاده از سرم هاى رقیق دشه توصیه مى شود که آزمایش RPA به کار رود.

·        کیفیت سرم : کیفیت نازل سرم مى تواند موجب افزایش تعداد پاسخ هاى مثبت کاذب شود سانتریفوژه این سرم ها ممکن است به کاهش این مشکل کمک کند.

·        سرم هاى منجمد : سرم هایى که منجمد شده اند مى توانند در ازمایش هاى RPA جواب هاى مثبت کاذب نشان دهند بنابراین زمانى مى توان از این آزمایش ها استفاده کرد که نتایج منفى باشند . اگر پاسخ هاى RPA حاصله از این سرم ها مثبت باشند لازم به نظر مى رسد که با استفاده از آزمون دیگرى مجدداً بررسى شوند .

·        واکنش هاى متقاطع با آلودگى ناشى از عامل دیگرى که آنتى ژن هاى مشترک دارند مایکوپلاسماهاى گالى سپتیکوم ، سینوویه و ایمیتانس نسبت هاى آنتى ژنى دارند به ویژه در طول فاز حاد یک عفونت مایکوپلاسمایى ، واکنش هاى متقاطع را میتوان در آزمایش هاى انجام یافته بر روى گونه هاى مایکوپلاسماى داراى قرابت دید بنابراین در طى یک درگیرى حاد با مایکوپلاسما سینوویه یا ایمیتانس ، آزمایش هاى سرمى Mg ممکن است تا اندازه اى واکنش هاى متقاطع نشان دهند به طور متوسط تست هاى سرولوژیک بررسى Mg و Ms در سرم هاى پرندگانى که به تازگى با یک سویه ى هترولوگ مایکوپلاسما آلوده شده اند نسبت به سرم هاى پرندگان غیر آلوده نتایج مثبت کاذب بیشترى نشان مى دهند .

·        سرم هاى به دست آمده از طیور مسن تر : مشخص شده است که پرندگان مسن تر عوامل غیر اختصاصى زیادترى از پرندگان جوان در سرم خونشان وجود دارد تصور مى شود IgG طیور یا یک پروتئین مثل عامل روموتوئید موجب بیشتر واکنش هاى غیر اختصاصى در طیور مسن تر مى شود غیر فعال کردن سرم ببا حرارت دادن منجر به تغییر ماهیت ایمنوگلوبولین هاى غیر اختصاصى مى شود و از این طریق میتوان به کاستن از واکنش هاى غیر اختصاصى به ویژه در ازمایش RPA کمک کرد.

·        واکسن هاى کشته که اخیرا مصرف شده باشند در برخى گله هایى که به تازگى یک واکسن کشته دریافت کرده اند ممکن است در بررسى سرمى مایکوپلاسما موقتا مشکلى با پاسخ هاى مثبت کاذب دیده شود . این واکنش ها معمولا در فاصله زمانى بین هفته هاى 2 تا 6 پس از آن ناپدید مى شوند

·        پل زدن یعنى چسبیدن غیر اختصاصى سرم به گوده ى پلیت : استفاده از سرم هاى داراى چربى بالا مى تواند مو جب افزایش تعداد نتایج مثبت کاذب شود.

با نگاه به فهرست دلایل احتمالى واکنش هاى مثبت کاذب ممکن است شخص از این تعجب کند و در ذهنیت اونگنجد که هنوز گله هاى منفى از لحاظ سرمى وجود دارند. در سال 2001 براى تعیین ویژگى آزمایش RPA براى Mg و Ms مطالعه اى در آلمان بر روى 66506 سرم جدا شدهاز نمونه هاى فیلد انجام گرفت و ویژگى آزمایش RPA براى Mg با استفاده از سرم رقیق نشده و رقت هاى 12 ، 14، 18 بررسى و نشان داده شد که این پارامتر به ترتیب 7/95 ، 1/99 ،6/99، 9/99 درصد براى سرم هاى فوق الذکر است براى آزمایش RPA براى Ms با استفاده از 393/22   سرم جدا شده از نمونه هاى فیلد ویژگى آزمون براى سرم رقیق نشده رقت هاى 12 ، 14 ، 18 به ترتیب برابر 6/97 ، 99 ، 7/99 ، 9/99 درصد تعیین شد. این اطلاعات توصیه ى oie مبنى بر استفاده از سرم هاى رقیق شده را براى سرولوژى مایکوپلاسماها توجیه مى کند.

مثبت هاى کاذب مشکوک

بیشتر واکنش هاى متقاطع و پاسخ هاى مثبت کاذب ناشى از کاربرد اخیر واکسن هاى کشته ضعیف و موقت هستند . بررسى مجدد همان نمونه ها با همان تست آزمایشگاهى براى حل مشکل این نتایج مثبت کاذب اکثرا بى فایده است . یک راه حل بهتر براى کاهش تعداد نتایج مثبت کاذب آزمایش مجدد سرم هاى داراى نتیجه مثبت با یک روش آزمایشگاهى دیگر است که به ان تست تاییدى هم گفته مى شود این آزمون دوم حداقل بایست به همان حساسیت اولى و آزمونى مستقل باشد به عنوان مثال آزمایش RPA و تست HI ( Mg ) یا ELISA .

راه حل دوم نمونه گیرى جدید از گله است این مى تواند شامل نمونه هاى جدید خون باشد ولى همچنین مى تواند سوآبهاى ناى براى آزمایش PCR هم باشد زمانى که واکنش هاى متقاطع و واکسن هاى غیر فعال شده عامل بروز مسایل باشند تیترها معمولا پس از چند هفته افت خواهند کرد.

تعداد نمونه

براى تشخیص سریع آلودگى هایى که اخیرا اتفاق افتاده اند از طریق سرولوژى تکرار نمونه بردارى تعداد نمونه وفاصله زمانى بین آلودگى و تغییرات سرمى مورد انتظار فاکتورهاى مهمى به شمار مى ایند براى پى بردن به وجود آلودگى جدید آزمایش یک پرنده به طور روزانه بهتراز آزمایش تمام پرندگان به صورت یک بار در سال است تکرار بیشتر نمونه بردارى توسط زمان بین آلودگى و تشخیص را کوتاه تر میکند. در موارد آلودگى ها ى مایکوپلاسمایى جدید تعداد نسبتا ً زیاد نمونه لازم است تا قادر باشیم آلودگى هایى را که هنوز میزان شیوع پایینى دارند تشخیص دهیم این تعداد نسبتاً زیاد نمونه ها آزمایشى با ویژگى فوق العاده را طلب مى کند تا ویژگى گله را در سطح قابل قبولى حفظ کند.

حساسیت گله

حساسیت گله عبارت است از شانس تعیین یک آلودگى درگله به طورى که حداقل یک نمونه مثبت باشد به سادگى قابل درک است که نمونه هاى بیشتربه معناى قائل شدن احتمال بیشتر براى تشخیص است .

ویژگى گله

ویژگى گله عبارت است از شانس اینکه در یک گله غیر آلوده تمام نمونه هاى مورد آزمایش منفى باشند انجام آزمایش بر روى تعداد نمونه بیشتر منجر به افزایش خطر داشتن یک پاسخ مثبت کاذب یا بیشتر از ان مى شود.  

ویژگى گله برابر است با :

                                                                                       ⁿ (specificity ) = ویژگى گله

به طورى که n تعداد نمونه هاست . مثلاً اگر ویژگى براى یک نمونه 99 درصد باشد ویژگى گله براى 60 نمونه برابر است با : 55 % = 60 (990/0 ) بدین معنا که در این شرایط تنها 55 درصد از گله هاى غیر آلوده نتایج فقط منفى خواهند داشت و 45 درصد دیگر این گله ها نتایج مثبت کاذب به تعداد یک یا بیشتر خواهند داشت بنابراین اخذ نمونه هاى بیشتر نه تنها شانس تشخیص آلودگى را بالا مى برد بلکه احتمال نتایج مثبت کاذب را هم افزایش مى دهد وقتى که میزان شیوع آلودگى درگله پایین است تعداد زیادى نمونه باید اخذ شود که در این صورت ویژگى گله کاهش خواهد یافت . بنابراین تعداد نمونه ها را بایست به دقت مورد بررسى قرارداد نه خیلى کم ونه چندان زیاد البته این نکته فهم آسانى دارد ولیکن انجام دادن آن دشوار است فرمول و روش محاسبه تعداد نمونه موردنیاز به صورت نمونه بردارى تصادفى براى تعیین عفونت با قطعیت 95 درصد قطعیت جهت گله هاى با تعداد مشخص و میزان شیوع معین نشان مى دهد تعیین یک آلودگى جدید با Mg یا Ms که هنوز میزان شیوع پایینى دارد به نمونه هاى زیادترى نیازمند است تا یک آلودگى قدیمى با میزان شیوع بالا که درصد زیادى از پرندگان آلوده اند پس براى یک برنامه کنترل مراقبت از مرغ هاى مادر معمولا ً نمونه هاى بیشترى اخذ مى شود تا بررسى وضعیت گله هاى تخمگذار پیر.

نتیجه گیرى

آزمایش خون ابزارى مهم براى تشخیص عفونت هاى مایکوپلاسمایى است چندین سیستم بررسى کننده را مى توان به کاربرد که هیچ یک بر دیگرى ارجحیتى ندارد اگر چه ممکن است میزان نتایج مثبت کاذب در میان آزمایش هاى سرولوژى مختلف به طرزمعنى دارى متفاوت باشد با این حال در هر آزمایش مى توان سطح معینى از پاسخ هاى مثبت کاذب را انتظار داشت بنابراین توصیه مى شود که فقط روى یک آزمون به تنهایى متکى نبوده وبه آن اطمینان کامل نداشته باشیم استفاده از یک آزمایش تایید کننده موکداً سفارش مى شود مهم است که از انتخاب یک آزمایش یا تفسیر نتایج حاصل از یک آزمایش خاص بدون دانستن عملکرد فنى آن اجتناب شود و همچنین اهمیت دارد که امکان استفاده از سیستم هاى آزمایشى دیگرى هم به عنوان جایگزین داشته باشیم علاوه بر یک قسمت تاییدى سرولوژیک به کار بردن آزمایش PCR در برنامه هاى کنترل مایکوپلاسما مى تواند بسیار مفید و موثر باشد . در مواردى که پاسخ هاى سرمى مثبت یا مشکوک در گله اى که سابقاً عارى از مایکوپلاسما بوده است به دست مى آید به کمک بررسى سوآبهاى نامى با روش PCR میتوان وضعیت واقعى و فعلى آن گله یا گله هایى را که در مجاورت آن هنوز از لحاظ سرمى منفى هستند سریعا تاکید کرد با این حال از آنجا که ازمونهاى PCR هم کامل نیستند موقعیت هایى به وجود مى ایند که کشت وتعیین تیپ سویه هاى مایکوپلاسما توسط ازمایش هاى معمول از قبیل IFA ضرورت مى یابد.

مختصر و شاید مفید !

·        هیچ تست کاملى وجود ندارد حتى الامکان از یک روش مناسب استفاده شود که زمان زیادى نگیرد.

·        براى تشخیص عفونت هاى جدید اخذ 60 نمونه توصیه مى شود.

·        تکرار نمونه گیرى بسیارمهم است تا در زمان مناسب آلودگى هایى را که به تازگى رخ داده اند بیابیم .

·        هرچه تعداد نمونه زیادتر باشد پاسخ هاى مثبت کاذب هم بیشتر خواهند بود بنابراین شایسته است از یک آزمون تایید کننده استفاده شود .

·        تولید آنتى بادى به زمان نیاز دارد یک هفته براى یک پرنده و 3 هفته براى کل گله .

·        براى تشخیص هاى خیلى زود به ویژه آَشیانه ها یى که در نزدیکى آشیانه جدیداً مبتلا شده واقعند استفاده از PCR مى تواند بسیار مفید باشد.

·        در طى فاز حاد عفونت درمان با آنتى بیوتیک ها میتواند پاسخ سرولوژیک گله را به تاخیر بیندازد.

·        سویه هایى وجود دارند که تشخیص آنها با هرگونه آزمایش مشکلتر از سایرین است .

·        براى واریانت هاى آنتى ژنى ، سویه هاى نامشخص سویه هاى باتوان ایمنى زایى کم ، مایکوپلاسما ایمیتانس کشت یا PCR مى تواند بسیار کمک کننده باشد .

·        اعتماد و تکیه بر روى یک آزمایش تنها یک اشتباه است و بس .

دنیاى کشت وصنعت

دکتر محمد عبدالشاه – دامپزشک مزرعه مرغ مادر